cdna第二条链的合成方法（cDNA文库的cDNA）

本文目录

• cDNA文库的cDNA
• 为什么要用总RNA获得cDNA
• 合成cDNA第二条链的U3-R-U5-PBS序列时,PBS序列是怎么合成的,以什么为模板
• 可以从基因文库中获得目的基因，则合成cDNA的过程中，反应体系内加入的物质除mRNA和ATP外,
• 简述cDNA第一链与第二条链的合成方法
• 求教cDNA制备的一般方法 RT,一般的步骤就行,
• cDNA文库中，单链DNA如何变为双链cDNA！快！会给好评,谢谢喽～
• RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
• 组建cDNA文库的组建有哪些步骤

cDNA文库的cDNA

cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’-末端,必须从3’-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法

为什么要用总RNA获得cDNA

确实需要RNA酶，但是RNA酶的作用是水解RNA不是合成mRNA~~cDNA文库的建立流程：提取mRNA——cDNA第一条链的合成——cDNA第二条链的合成——cDNA末端处理cDNA第一条链的合成：在这一步里，只需要逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶），以mRNA为模板合成DNA。这一步里最忌有RNA酶了（要不然就没有模板了！）~~这一步最后生成mRNA-cDNA复合体cDNA第二条链的合成：这个时候就是你问题里由mRNA-cDNA复合体合成cDNA了。这个时候是用DNA聚合酶以DNA为模板~最后就得到双链DNA了，就是我们要的cDNA！！！所以你的问题就解决了吧：要用RNA酶把mRNA水解掉，然后DNA聚合酶才能结合到模板上，聚合生成DNA~~

合成cDNA第二条链的U3-R-U5-PBS序列时,PBS序列是怎么合成的,以什么为模板

合成cDNA的第二条链肯定是设计引物后以cDNA第一链为模板进行扩增啊.cDNA第一链是通过RNA逆转录而来.所以实验顺序是：RNA提取——第一链cDNA合成——第二链cDNA合成.

可以从基因文库中获得目的基因，则合成cDNA的过程中，反应体系内加入的物质除mRNA和ATP外,

这是因为基因组文库的基因和cDNA的基因不会同时出现（可以理解为：基因组文库的目的基因产生基因mRNA后，只提炼该mRNA逆转录形成cDNA。此时的目的基因已经不在提取液中了，所以限制酶不会对其有作用）。cDNA产生的步骤如下：

• 1） cDNA 第一链的合成：用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3’ 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3’ 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3’ 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。

• 2）. 双链 cDNA 的合成：合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3’ 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5’ 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5’ 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。

• 3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：① 借助于末端转移酶的 3’ -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3’ -OH 端分别加上均聚核苷酸链；② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体；③ 通过粘性末端连接。

• 4）. 转化：重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。

• 5）. 目的 cDNA 克隆的鉴定：用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种：① 核酸杂交 ②免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择

简述cDNA第一链与第二条链的合成方法

通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后，变可进行cDNA第一链的合成，其步骤包括：
1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。
2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。
3)向上述反应混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl，1mol／L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol／L KCl7μl，250m mol／L MgCl22μl，再加20 m mol／L的4种dNTP各2.5μl，逆转录酶2μl（40单位），用水补充到50μl，充分混匀，42℃反应1～3小时。
4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应，然后加150m mol／L NaOH 25μl，65℃反应1小时，或37℃8小时，水解mRNA模板，得到cDNA第一链，再加pH8.0，1m mol／L Tris.HCl，各25μl中和其pH。
5)测定放射活性，计算合成的DNA量。实际上，cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%。
6)用等体积的酚-氯仿抽提―次，取水相并用SephadexG-100离心柱层析(参看第6章)将cDNA同剩余的dNTP分开，以2.5倍体积的95％冷乙醇沉淀。
7)合成的cDNA第―链在1.4％的碱性琼脂糖凝胶上电泳，用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准，电泳后，铺X-光片，进行放射自显影，确定cDNA第一链的大小。
2：第二链的合成
a:第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入
2.5×第二链缓冲液40μl，
DNA聚合酶Ⅰ23μ
RNase H 0.8μ
加水至100μl
b: 14-16℃下放置2小时。(》3Kb时反应时间延长至3-4小时)
c：70℃，10min，点动离心,置于冰浴
d: 在样品管中加入T4DNA聚合酶2μ,37放置10分钟。
e：加入4μl 500mM的EDTA到该样品管中,然后置于冰浴上.
f: 等体积加入酚\氯仿\异戊醇抽上清,12000g，3min。
g: 上清液转移至一干净试管,加2V乙醇,1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀,12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀,干燥,TE复溶。

求教cDNA制备的一般方法 RT,一般的步骤就行,

一、制备用于克隆cDNA的mRNA
1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法
2.磁珠法分离mRNA
注意：一般需要做mRNA完整性的检测（检查mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力、mRNA分子的大小等）；如果用于制备cDNA文库则还需要检测mRNA在细胞中的丰度.
二、cDNA第一链的合成
1、oligo(dT)引导的DNA合成法:利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
2、随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始.
三、cDNA第二链的合成
1、自身引导合成法:
单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排.S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
2、置换合成法
原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3、引物-衔接头法

cDNA文库中，单链DNA如何变为双链cDNA！快！会给好评,谢谢喽～

cDNA是通过mRNA反转录来的，以随机六聚体引物，或Oligo（dT）引物或者特异引物在反转录酶作用下合成第一链cDNA随后再通过普通PCR，以特异引物扩增出双链cDNA.反转录试剂盒里讲的很清楚

RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的

RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：
一、cDNA第二链的合成:
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
二、双链cDNA末端补平:
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

组建cDNA文库的组建有哪些步骤

（1）制备mRNA：通常mRNA约占总RNA的1%5%，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获取胰岛素基因，应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料。

将提取的总RNA在寡聚脱氧核苷酸纤维素中进行亲和层析，分离获得mRNA。

（2）cDNA第一链的合成：所有cDNA第一链的合成方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。与cDNA第一链合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3′端poly（A）互补的1218个核苷酸长的oligo（dT），沿模板的3′→5′方向合成，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）。对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA。

（3）cDNA第二链的合成：通常有自身引导合成法和置换合成法两种方法合成。自身引导合成法。用碱处理mRNA-cDNA杂交体，水解mRNA模板，cDNA第一链3′端能够形成发夹结构，这种结构可用作合成cDNA第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段或反转录酶的作用下，以四种dNTP为原料完成双链cDNA的合成，利用这种方法合成的双链DNA产物，在其末端相应于mRNA：5′端的位置借一发夹结构闭合成环，再用单链特异性的S1核酸酶消化此环，得到双链cDNA分子，方可经适当的方法克隆到载体中。置换合成法。这是以cDNA第一链的合成产物mRNA-cDNA杂交体为模板，利用RNA酶H和DNA聚合酶I共同催化的切口平移反应，合成cDNA第二链的方法。

RNA酶H在杂交体中的mRNA链上造成切口或缺口，emphasis：role=italicE：coli：emphasisDNA聚合酶I以RNA片段为引物，合成DNA链，取代模板上的mRNA；这些DNA片段经T4噬菌体DNA连接酶连接，形成完整的cDNA第二链。这种方法最大的优点是可以获得十分接近全长的双链cDNA产物，另外还有直接利用第一链的反应产物、无须处理和纯化以及很高效率的特点。

（4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞：cDNA片段与载体DNA的连接就是在一定的条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5′-P与3′-OH之间形成磷酸二酯键的过程。由于T4：DNA连接酶的底物范围广，尤其是能有效地连接DNA的平末端，故其应用最广泛。连接后将靶DNA通过适当方法导入受体细胞，使其进行大量复制、增殖和表达，从而获取大量的克隆基因。